Microscopía Electrónica

La plataforma de microscopía electrónica permitirá a los investigadores de ISABIAL como a otras instituciones públicas y privadas disponer de las últimas tecnologías en microscopía electrónica y preparación de muestras biológicas, así como congelación por alta presión (HPF), criosustitución (ASF) y corte en serie automatizado de ultrafinos (ARTOS 3D). La microscopía electrónica permite el estudio a nivel ultraestructural de material biológico (células, biopsias o tejidos tanto animales como vegetales) y obtención de imágenes en 3D, gracias a la tomografía (Array Tomography). Además, en la unidad se podrá correlacionar imágenes de microscopía electrónica y de fluorescencia, técnica que aporta tanto información funcional como ultraestructural de las muestras de estudio. También, el microscopio electrónico permite la caracterización morfológica de materiales de forma directa, así como su composición mediante técnicas espectroscópicas asociadas.

• Asesoramiento metodológico para el procesamiento de muestras biológicas para la Microscopía Electrónica.
• Congelación por alta presión de las muestras (HPF).
• Criosustitución e inclusión a resina Epoxi o Acrílica (ASF2).
• Fijación e Inclusión de muestras a temperatura ambiente en resina Epoxi o Durcupan.
• Cortes semifinos con el ultramicrotomo de material incrustado en resina para evaluar por microscopía óptica (Zeiss Axio Observer 7). Tinciones con colorante azul de toluidina y montaje de muestras.
• Cortes ultrafinos en rejilla para microscopía electrónica STEM.
• Cortes ultrafinos seriados en oblea (wafer) de silicio o cubres ITO para Array Tomography (Volume EM).
• Manejo Microscopio de Fluorescencia invertido Zeiss Axio Observer 7 con Apotome3.
• Manejo del Microscopio FE-SEM GeminiSEM 460 (Zeiss) en modo barrido o STEM.
• Asesoramiento en el análisis de imágenes.

La plataforma de microscopía electrónica del ISABIAL está totalmente equipada para la preparación de muestras, pudiendo realizarse los procesos de fijación, postfijación, deshidratación e inclusión en resinas de tipo epoxi y acrílicas usando moldes de silicona. Estas resinas van a proporcionar a dicho material biológico el soporte y la dureza necesarios para su corte con el ultramicrotomo, obteniéndose secciones semifinas (0,5-2 µm) o ultrafinas (60-100 nm) y su posterior observación en el microscopio.

La plataforma de microscopia electrónica de ISABIAL pone en valor la técnica que mejor conserva la ultraestructura de las diferentes muestras biológicas. Está técnica poco utilizada en microscopia electrónica convencional es la congelación por alta presión o HPF (del inglés High Presassure Freezing). La HPF permite congelar el tejido a alta presión, aprovechando la propiedad física del agua que, a altas presiones, pasa de estado líquido a sólido no cristalino sin formar cristales de hielo que pueden alterar la estructura del espécimen. Esta HPF junto con la posterior criosustitución e inclusión en resina permite conservar de la mejor manera el tejido, y obtener una imagen más real en el microscopio de la estructura del tejido. Con el microscopio óptico se pueden obtener mosaicos de las secciones de vibratomo o de los cortes semifinos realizados con el ultramicrotomo y teñidos con azul de toluidina y con el electrónico se puede observar la ultraestructura de la muestra. Una característica fundamental para la observación al microscopio electrónico de cualquier muestra biológica es la interacción que se produce entre esta y el haz de electrones. Generalmente, y con el fin de mejorar dicha interacción, es necesario un proceso de contraste de las secciones con metales pesados (osmio, acetato de uranilo o citrato de plomo).

Por otro lado, la plataforma cuenta con un ultramicrotomo de última generación (Leica ARTOS 3D), que es un equipo semiautomático de cortes ultrafinos (ultrafinos de 60-90nm), que permite el corte seriado de varios cientos a miles de secciones (array tomography), que luego pueden ser escaneados por el microscopio de barrido (Zeiss GeminiSEM 460), para realizar una reconstrucción 3D de las diferentes muestras. Incluso se puede compaginar para realizar CLEM (Corralative Light and Electron Microscopy) de las diferentes muestras. Para ello, el equipo dispone de adaptadores para escanear las muestras en el microscopio de Fluorescencia invertido (Zeiss Axio Observer 7 con Apotome 3) y después escanear la misma área en el microscopio electrónico, lo que permite correlacionar donde se localiza la señal fluorescente dentro de un tejido o dentro de una célula (en función del marcaje fluorescente que presente la muestra de estudio). Este microscopio de fluorescencia, además, permite capturar imágenes multimodales de muestras vivas y fijas, permitiendo la realización de imágenes de áreas extensas o para un seguimiento detallado de muestras en crecimiento o cambio. Con la adición de Apotome 3 se permite el seccionamiento óptico en la captura de imágenes de fluorescencia. Esto significa que elimina la luz desenfocada, lo que mejora la calidad de las imágenes y permite una observación más detallada de las estructuras fluorescentes.

La microscopía electrónica 3D con congelación a alta presión ha demostrado ser fundamental por lo que tendrá un gran impacto en la investigación en biomedicina, así como en neurociencias y diagnóstico de las enfermedades neurodegenerativas, entre ellas las neuropatías periféricas hereditarias. Esta tecnología no está disponible dentro de las diferentes áreas de salud ni universidades de la provincia de Alicante.

La plataforma podrá recibir las diferentes muestras en cualquier fase de la preparación para el microscopio electrónico, completándose el proceso en la plataforma. En aquellos casos en los que el usuario sólo requiera la utilización del microscopio electrónico, deberá igualmente ponerse en contacto con el Laboratorio e indicar la naturaleza de la muestra a observar.