Microscopía

La PLATAFORMA DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA, permitirá a los investigadores de ISABIAL como a otras instituciones públicas y privadas disponer de las últimas tecnologías en microscopía electrónica y preparación de muestras biológicas, así como congelación por alta presión (HPF), criosustitución (ASF) y corte en serie automatizado de ultrafinos (ARTOS 3D). La microscopía electrónica permite el estudio a nivel ultraestructural de material biológico (células, biopsias o tejidos tanto animales como vegetales) y obtención de imágenes en 3D, gracias a la tomografía (Array Tomography). Además, en la unidad se podrá correlacionar imágenes de microscopía electrónica y de fluorescencia. La utilización adicional de técnicas inmunocitoquímicas, aporta además información funcional y ultraestructural de las muestras de estudio. También, el microscopio electrónico permite la caracterización morfológica de materiales de forma directa, así como su composición mediante técnicas espectroscópicas asociadas.

• Asesoramiento metodológico para el procesamiento de muestras biológicas para la Microscopía Electrónica.
• Congelación por alta presión de las muestras (HPF).
• Criosustitución e inclusión a resina Epoxi o Acrílica (ASF2).
• Fijación e Inclusión de muestras a temperatura ambiente en resina Epoxi o Durcupan.
• Cortes semifinos con el ultramicrotomo de material incrustado en resina para evaluar por microscopía óptica (Leica Thunder Imager). Tinciones con colorante azul de toluidina y montaje de muestras.
• Cortes ultrafinos en rejilla para microscopía electrónica STEM.
• Cortes ultrafinos seriados en oblea (wafer) de silicio o cubres ITO para Array Tomography (3D).
• Manejo del microscopio FE-SEM GeminiSEM 460 (Zeiss) en modo barrido o STEM.

La plataforma de microscopía electrónica del ISABIAL está totalmente equipada para la preparación de muestras, pudiendo realizarse los procesos de fijación, postfijación, deshidratación e inclusión en resinas de tipo epoxi y acrílicas usando moldes de silicona. Estas resinas van a proporcionar a dicho material biológico el soporte y la dureza necesarios para su corte. A partir de estos moldes de resina, pueden obtenerse secciones micrométricas de material perfundido o incluido en soportes blandos con vibratomo (50-200 µm de grosor). En el ultramicrotomo, se obtienen secciones semifinas (0,5-2 µm) seriadas o ultrafinas (60-100 nm). En el microscopio óptico, se pueden obtener mosaicos de las secciones de vibratomo o semifinas teñidas con azul de toluidina. Una característica fundamental para la observación al microscopio electrónico de cualquier muestra biológica es la interacción que se produce entre esta y el haz de electrones. Generalmente, y con el fin de mejorar dicha interacción, es necesario un proceso de contraste de las secciones con metales pesados (osmio, acetato de uranilo o citrato de plomo). La plataforma podrá recibir las diferentes muestras en cualquier fase de la preparación para el microscopio electrónico, completándose el proceso en la plataforma. En aquellos casos en los que el usuario sólo requiera la utilización del microscopio electrónico, deberá igualmente ponerse en contacto con el Laboratorio e indicar la naturaleza de la muestra a observar.

Además, la plataforma de microscopia electrónica de ISABIAL pone en valor la técnica que mejor conserva la ultraestructura de las diferentes muestras biológicas. Está técnica poco utilizada en microscopia electrónica convencional es la congelación por alta presión o HPF (del inglés High Presassure Freezing). La HPF permite congelar el tejido a alta presión, aprovechando la propiedad física del agua que, a altas presiones, pasa de estado líquido a sólido no cristalino sin formar cristales de hielo que pueden alterar la estructura del espécimen. Esta HPF junto con la posterior criosustitución e inclusión en resina permite conservar de la mejor manera el tejido, y obtener una imagen más real de la estructura del tejido. Además de la HPF, la plataforma cuenta con un ultramicrotomo de última generación (Leica ARTOS 3D), que es un equipo semiautomático de cortes ultrafinos (ultrafinos de 60-90nm), que permite el corte seriado de varios cientos a miles de secciones, que luego pueden ser escaneados por el microscopio de barrido (Zeiss GeminiSEM 460), para realizar una reconstrucción 3D de las diferentes muestras. Incluso se puede compaginar para realizar CLEM (Corralative Light and Electron Microscopy) de las diferentes muestras. Para ello, el equipo dispone de adaptadores para escanear las muestras en el microscopio confocal (Zeiss LSM) y después escanear la misma área en el microscopio electrónico, lo que permite correlacionar donde se localiza la señal fluorescente dentro de un tejido o dentro de una célula (en función del marcaje fluorescente que presente la muestra de estudio). La técnica Array Tomography permite realizar cortes seriados de una muestra para hacer una reconstrucción en 3D y poder observar la morfología de los componentes de la muestra.

La microscopía electrónica 3D con congelación a alta presión ha demostrado ser fundamental por lo que tendrá un gran impacto en la investigación en biomedicina, así como en neurociencias y diagnóstico de las enfermedades neurodegenerativas, entre ellas las neuropatías periféricas hereditarias. Esta tecnología no está disponible dentro de las diferentes áreas de salud ni universidades de la provincia de Alicante.